碩果累累 | 復旦大學舒易來主任致力于遺傳性耳聾基因治療及臨床轉化

聽力喪失是最常見的感官障礙之一，影響著很多人。根據世衛組織公布的《世界聽力報告》，現有超15億人患有不同程度的聽力損失，到2050年，患聽力損失的人數將近25億。據統計，大約50%的先天性聽力損失與遺傳因素有關，目前臨床上的治療方案主要為佩戴助聽器或植入人工耳蝸，但此類方法沒有基于病因學從根本上治愈聽力損傷。因此，治療聽力損失需要更好的替代療法。隨著基因治療的蓬勃發展，基于病毒載體的基因療法成為治療遺傳性聽力損失的新熱門賽道。

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院舒易來主任長期致力于研究耳聾基因治療及臨床轉化，在顯性和隱性遺傳性耳聾、后天性耳聾的防治上取得了諸多進展，為耳聾的治療開辟了新方向。

2021年6月，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院舒易來主任、李華偉教授與中國農業科學院（深圳）農業基因組研究所左二偉研究員等團隊合作在Molecular Therapy上發表題為Gene editing in a Myo6 semi-dominant mouse model rescues auditory function的研究論文[1]。該研究以模擬顯性感音神經性耳聾小鼠模型（Myo6^WT/C442Y鼠）為對象，借助AAV-PHP.eB基因治療遞送載體，搭載CRISPR/Cas9基因編輯系統（AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-Myo6-g2），高效轉染內耳毛細胞，實現了在體特異性敲除Myo6^C442Y等位基因，并在長達5個月的時間內觀察到了聽覺功能的恢復。這也是國際上第一個利用CRISPR/Cas9技術針對Myo6基因突變導致的遺傳性耳聾進行治療，并獲得成功的研究。為遺傳性耳聾基因治療臨床轉化提供了堅實的科學依據。

AAV-PHP.eB攜帶CRISPR/Cas9系統進行體內基因編輯（PMID: 34174443）

病毒產品	AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-Myo6-g2
實驗動物	P0-2 Myo6WT/C442Y鼠
注射方式	RWM
感染部位	內耳毛細胞
病毒用量	共0.5μL

在遺傳性耳聾中，隱性遺傳占大多數。2022年2月，三位科學家又合作在Cell Research在線發表題為“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究論文[2]。該研究以AAV-PHP.eB和AAV9雙載體作為高效的基因治療遞送載體，轉染Klhl18^lowf鼠耳蝸內毛細胞，成功糾正了Klhl18基因C>A點突變，持久改善了聽覺功能。首次實現基于CRISPR/Cas9-HMEJ技術治療隱性遺傳性感音神經性聾成功的研究，為遺傳性耳聾的精準治療以及臨床轉化提供了強有力的科學證據。（閱讀原文：Cell Res | 舒易來/李華偉/左二偉團隊開發CRISPR/Cas9-HMEJ系統取得遺傳性聾基因治療新突破）

設計HMEJ同源重組治療方案。a 針對篩選的sgRNA，設計HMEJ同源臂。b 基于AAV作為體內遞送載體的雙AAV治療體系，其中一個AAV遞送用于表達Cas9的載體，另外一個遞送表達sgRNA以及攜帶同源臂的載體。（PMID: 35197607）

病毒產品	AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor
實驗動物	P1 Klhl18lowf鼠
注射方式	RWM
感染部位	耳蝸
病毒用量	共0.5μL

基于RNA靶向CRISPR/CasRx系統具有特異性識別和編輯RNA的能力。同年3月，復旦大學舒易來主任、李耕林研究員與中國農業大學胡曉湘教授合作發現基于CRISPR/CasRx編輯系統在治療常染色體顯性遺傳性聽力損失中的作用。研究以高效的基因治療遞送載體--AAV-PHP.eB遞送特異性靶向和編輯RNA的CRISPR/CasRx系統至Bth鼠內耳中，Bth鼠為Tmc1基因突變的顯性耳聾小鼠模型，借助CRISPR/CasRx系統敲低Tmc1^Bth等位基因的轉錄本，有效改善了毛細胞和靜纖毛束的形態，防止了進行性聽力損失。該研究成果發表在Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊，標題為：Preventing autosomal-dominant hearing loss in Bth mice with CRISPR/CasRx-based RNA editing[3]。

AAV- CRISPR/CasRx系統進行體內基因編輯方案（PMID: 35283480）

病毒產品	AAV-PHP.eB-CMV-CasRx-U6-sgRNA3
實驗動物	P1-2 Bth鼠
注射方式	RWM
感染部位	內耳毛細胞
病毒用量	~1.5μL（~5E+9vg）

感音性耳聾有先天與后天之分，后天性耳聾是耳聾患者的重要部分，致聾原因主要包括耳毒性藥物、噪音、老化、感染等因素，目前尚無可治療的藥物（突發性耳聾除外）。2022年4月，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院舒易來主任、李華偉教授與陳兵教授團隊借助CRISPR-CasRx的RNA編輯技術成功防治了耳毒性藥物引起的后天性感音神經性耳聾。研究成果發表在Molecular Therapy-Nucleic Acids 雜志上，題為：Specific knockdown of Htra2 by CRISPR-CasRx prevents acquired sensorineural hearing loss in mice[4]。該研究基于前期研究成果，通過AAV- PHP.eB-RfCas13d-sgRNA3高效轉染幼鼠內耳毛細胞，借助RfCas13d特異性靶向并高效切割RNA的特性，下調幼鼠內耳毛細胞中Htra2基因表達，顯著提升了氨基糖甙類抗生素（aminoglycosides，AGs）暴露后小鼠耳蝸毛細胞的存活，并明顯改善了后天性感音神經性耳聾小鼠的聽覺功能。該研究創新性地以CRISPR-CasRx 基因編輯技術在小鼠模型中實現了高效敲降靶點RNA的目的，證明了CRISPR-CasRx系統在臨床上防治后天性耳聾具有巨大的應用潛力。

AAV-CRISPR-CasRx編輯系統改善了后天性感音神經性耳聾小鼠的聽覺功能（PMID: 35615000）

病毒產品	AAV-PHP.eB-CMV-RfCas13d-U6-sgRNA3
實驗動物	P1小鼠
注射方式	RWM
感染部位	內耳毛細胞
病毒用量	0.5μL（~5E+9vg）

2022年6月，舒易來團隊創新性構建Atoh1-GFP小鼠以準確檢測CRISPR/Cas9系統在內耳毛細胞中的編輯效率。并借助AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-g3高效轉染Kcnq^4+/G229D幼鼠內耳，顯著改善小鼠的聽覺功能。該研究為精準評估CRISPR/Cas9在體內的編輯效率提供了方向，促進了CRISPR基因編輯系統在疾病治療中的應用。該研究發表在Molecular Therapy-Nucleic Acids 雜志上，題為：Precise detection of CRISPR-Cas9 editing in hair cells in the treatment of autosomal dominant hearing loss[5]。

檢測CRISPR/Cas9系統在內耳毛細胞中的編輯效率及AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-g3基因編輯（PMID: 36035752）

病毒產品	AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-g3
實驗動物	P1-2 轉基因鼠
注射方式	RWM
感染部位	耳蝸
病毒用量	0.5μL

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相關論文鏈接：

[1] https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.06.015

[2] https://doi.org/10.1038/s41422-022-00624-y

[3] https://doi.org/10.1038/s41392-022-00893-4

[4] https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.04.014

[5] https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.07.016

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