CRISPR 小講堂之Cas蛋白

CRISPR/Cas這項明星技術自問世以來，已經吸引了無數歡呼和掌聲。在短短兩三年之內，它已經成為了生物科學領域最炙手可熱的研究工具。CRISPR/Cas技術的先驅者們，包括張鋒以及兩位**科學家珍妮弗·杜德娜和艾曼紐·夏邦杰，更是獲得了眾多榮譽和獎項。

那么，獲得科研人員們如此青睞的CRISPR/Cas技術究竟是什么？

CRISPR/Cas系統是在原核生物中發現的適應性免疫系統， 全稱是簇狀規則間隔的短回文重復序列（CRISPR）和相關蛋白（Cas）構成的CRISPR/Cas系統。

 

今天就帶大家首先了解一下CRISPR/Cas系統中的各類蛋白。Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。在CRISPR系統中含有很多種類的常見Cas蛋白，Cas1到Cas10以及如Cas8a1、Cas12a、Cas13a等比較稀少的類型。

 

 

圖1 Cas蛋白家族分類（Kira S. Makarova et al. 2017）。

 

 

依據Cas基因與位點結構之間的序列相似性將 CRISPR/Cas 系統分類，包括兩個大類五型系統：

第一類系統（包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型）存在于細菌和古生菌中，通常形成多亞基蛋白⁃crRNA（CRISPR RNA）效應復合物；

第二類系統（包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型），依賴于一個單一的crRNA引導蛋白進行目標干擾，即由一個單一的多域蛋白行使功能。

 

換而言之，劃分一類和二類CRISPR/Cas的標準就是看它的效應物的結構是不是特別簡單。第二類CRISPR/Cas系統的效應物無一不是一個蛋白質就能單槍匹馬完成所有的剪切任務的。而第一類CRISPR/Cas則是由多個蛋白組成復合體來執行切割功能的。

 

圖2 不同種類的Cas蛋白在不同種類的菌體中含量統計圖（Zhongjie Tang et al. 2019）。

 

 

上圖2則是CasPDB數據庫統計的在不同種類的菌體中所含的Cas蛋白數量分布，在統計的所有 Cas 蛋白中，Cas1占20.11% ，Cas2占17.46% ，Cas3、 Cas5、Cas6 和 Cas7占10% 以上。其余的較少，最著名的Cas9蛋白則在所有Cas蛋白中占2.59%，本文也將重點討論Cas9蛋白和Cas12、Cas13和Cas14這類能夠獨立對DNA/RNA進行切割的效應蛋白。

 

 

Cas家族蛋白

Cas1與Cas2蛋白是CRISPR系統中的核心蛋白，該類蛋白參與免疫過程第一階段外源片段的整合，而Cas3具有DNA的切割活性和解旋酶活性，是I型CRISPR/Cas系統中的核心酶，Cas4參與了外源DNA序列插入到細菌的DNA中的過程，主要存在于II-B和I-A/B/C/D型CRISPR/Cas系統中。Cas5 蛋白和其他蛋白形成Cascasde復合物來發揮功能，例如在大腸桿菌(I-E型)中，生成的crRNA-Cas6復合物會募集1個Cse蛋白、2個Cse2蛋白、6個Cse7蛋白和1個Cas5蛋白。Cas6負責將pre crRNA加工成成熟的crRNA。Cas7和Cas8都是Cascasde復合物的重要組成蛋白。

 

Cas10負責切割DNA鏈，是III型CRISPR/Cas系統的核心酶，Cas10通過和其他多個Csm/Cmr亞基及一條crRNA(CRISPR RNA)組裝成效應復合物。該效應復合物既可以降解RNA也可以降解DNA(ssDNA)。Cas11主要參與crRNA的結合，常見于III型CRISPR/Cas系統中。

 

 

除了上述這些Cas蛋白以外，Cas9、Cas12、Cas13和Cas14都是第二類系統中的核心單酶，已經被廣泛開發應用于基因編輯等技術中。接下來就給大家詳細介紹一下：

 

Cas9蛋白

Cas9是一種DNA內切酶，Cas9內切酶必須在向導RNA分子的引導下對DNA進行切割，這是因為這些向導RNA分子含有與靶DNA序列互補的序列，稱之為PAM序列。Cas9蛋白精確的平端切割位點位于PAM上游3個核苷酸位置，形成平末端產物。Cas9蛋白的HNH結構域負責切割與crRNA互補配對的那一條DNA鏈，而RuvC結構域負責切割另外一條非互補DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB）形成雙鏈DNA缺口，然后細胞會借助同源重組機制(homologous recombination)或者非同源末端連接機制(non-homologous end joining)對斷裂的DNA進行修復，進而實現DN**段的敲除或敲入。

 

圖3 CRISPR/Cas9基因編輯機制圖

 

 

Cas9的應用：

 

Cas9含有兩個具有切割活性的結構域：HNH結構域和RuvC結構域，其中HNH結構域切割與crRNA互補的DNA鏈，而RuvC結構域切割非互補鏈。RuvC結構域可分為三個亞結構域：RuvC I、RuvC II和RuvC III，RuvC I接近于Cas9的氨基端，RuvC II和RuvC III位于HNH結構域的兩側。僅對Cas9中的RuvC I進行突變，具體而言就是讓RuvC I的兩個關鍵氨基酸殘基中的一個轉換成丙氨酸（D10A或H840A），從而得到Cas9切口酶（Cas9 nickase, Cas9n）。這種切口酶不能切割非互補DNA鏈，僅能切割與crRNA互補的DNA鏈，能夠明顯減少脫靶效應，同時保持高效的基因修飾。

 

通過點突變的方式使Cas9的兩個結構域RuvC-和HNH-失去活性，其中RuvC催化結構域的第10位天冬氨酸突變為丙氨酸（D10A）以及HNH催化結構域的第840位組氨酸突變為丙氨酸（H840A），Cas9蛋白將失去核酸內切酶活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導下結合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結合到基因的轉錄起始位點，可以阻斷轉錄的開始，從而抑制基因表達；將dCas9結合到基因的啟動子區域也可以結合轉錄抑制/活化物，使下游靶基因轉錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會對基因組DNA造成不可逆轉的改變。

 

 

Cas12 蛋白

CRISPR–Cas12a蛋白，以前稱為Cpf1，是一種內切核酸酶，可以通過向導RNA進行編程，以靶向互補的DNA序列。在與靶DNA結合后，CRISPRCas12a蛋白在每條靶DNA鏈中誘導切割，產生雙鏈DNA斷裂。除了誘導靶DNA的順式切割之外，靶DNA結合還誘導非靶DNA的反式切割。因此，CRISPR Cas12a-RNA向導復合物可以提供針對入侵核酸（例如噬菌體和質粒）的序列特異性免疫。類似于CRISPR/Cas9，Cas12a已被重新用作原核和真核細胞中可編程基因組編輯和轉錄控制的遺傳工具。此外，其反式切割活性已應用于高靈敏度核酸檢測。CRISPR/Cas12a系統的脫靶率將比Cas9低得多，并且因為它與Cas9的諸多不同，它將能與CRISPR/Cas9互補，從而擴大CRISPR/Cas系統的工具箱，使基于CRISPR/Cas系統的基因編輯技術具有更強的普適性和編輯能力。

 

Cas12b核酸酶（又名C2c1）是依賴于RNA介導的內切核酸酶，在靶標DNA存在PAM的情況下，可特異地切割靶標雙鏈DNA。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，且來源于嗜酸耐熱菌且切割活性較高的Alicyclobacillus acidoterrestris。Cas12b的最佳切割反應溫度為48 ℃。和同家族的Cas12a類似，Cas12b也識別5'-TTN的PAM序列，切割DNA后也產生粘性末端；然而，Cas12b是雙RNA導向，依賴于crRNA和tracrRNA（或連接后形成的sgRNA）。此外，Cas12b不僅可以應用于靶標dsDNA的切割，還可以用于靶標核酸的快速檢測，詳見HOLMESv2核酸快檢技術。

 

 

Cas13 蛋白

Cas13蛋白可進一步分為4個亞型，即CRISPR-Cas13a,b,c,d。除了Cas13c的相關研究目前還不充分外，另外3中Cas蛋白已經有了比較廣泛的研究和應用。

 

Cas13a核酸酶（又名 C2c2）是依賴于 RNA 介導的 RNA 內切核酸酶。在靶標單鏈 RNA 存在 PFS序 列的情況下，可特異地切割靶標 RNA。此外，Cas13a 還具有依賴于靶標單鏈 RNA 的反式切割活性，可用于開發靶標核酸的快速檢測試劑盒。例如，MIT的張鋒團隊便利用 Cas13a 蛋白開發了名為“SHERLOCK”的下一代分子診斷系統。對于細菌而言，Cas13a這種反式切割活性是有意義的。若細菌被噬菌體感染，它能夠激活程序性細胞死亡或休眠狀態，以限制感染在整個群體中的傳播。像Cas13a一樣，Cas13b僅需要單個向導RNA就能靶向目的序列，此外，Cas13b能夠同時靶向多個RNA轉錄本。

 

而此后發現的Cas13d，具有更高的效率、更低的脫靶率，更重要的是，Cas13d相比其他Cas13家族成員具有更小的尺寸，能夠更容易包裝到病毒載體中，因此具有更好的遞送優勢和應用前景。

 

 

Cas14 蛋白

除了上述幾種具有靶向切割能力的Cas蛋白之外，近期發現的Cas14 也具有類似的功能。

 

Cas14a核酸酶是一種內切核酸酶，其在tracrRNA:crRNA（或sgRNA）的引導下，特異結合并切割靶標ssDNA，且無需PAM位點。相比于其他的Cas蛋白，Cas14蛋白的分子量普遍較�。�400-700aa）；與Cas12類似，Cas14a也可以結合靶標核酸并激活其ssDNA反式切割活性。研究人員認為，Cas14的切割對象是單鏈DNA，而不是雙鏈DNA，因此未必是良好的基因組編輯工具。不過，他們認為Cas14可用在DETECTR診斷工具中。

 

 

圖4 CRISPR-Cas9、 Cas12a、 Cas14和Cas13a基因編輯系統的基本組件（Feng W et al. 2021） 。

 

近岸蛋白提供CRISPR-Cas9技術所需的Cas9 蛋白（目錄號：E365）及其突變體蛋白，包括Cas9(D10A) Nickase（目錄號：E366）、Cas9(H840A) Nickase（目錄號：E367）和 (D10A，H840A)Nuclease（目錄號：E368）。近岸蛋白還提供LbaCas12a Nuclease（目錄號：E373） 和 LwaCas13a Nuclease（目錄號：E381），多種類的Cas蛋白是您科研道路上的得力幫手。同時，近岸蛋白還提供系列T7EI工具酶及sgRNA合成試劑盒等CRISPR/Cas9相關科研產品。

 

 

目錄號	產品名稱
E365	NLS-Cas9 Nuclease
E370	sgRNA Screening and Genotype Confirmation Kit
M017	T7 Endonuclease I
E366	Cas9(D10A) Nickase
E367	Cas9(H840A) Nickase
E368	Cas9(D10A，H840A)Nuclease
E373	LbaCas12a Nuclease
E379	NLS-Cas9-EGFP Nuclease
E381	LwaCas13a Nuclease
E369	sgRNA In Vitro Transcription Kit

 

 

引用文獻：

Feng W , Newbigging A M , Tao J , et al. CRISPR technology incorporating amplification strategies: molecular assays for nucleic acids, proteins, and small molecules[J]. Chemical Science, 2021.

Makarova,K.S.,Zhang,F.,&Koonin,E.V.(2017). SnapShot:class 1 CRISPR-Cas systems. Cell,168(5), 946-946.

Makarova,K.S.,Zhang,F.,&Koonin,E.V.(2017). SnapShot:class 2 CRISPR-Cas systems.Cell,168(1), 328-328.

Tang,Z., Chen,S.Q., Chen,A. et al.(2019). CasPDB: an integrated and annotated database for Cas proteins from bacteria and archaea. Database Vol. 2019: article ID baz093; doi:10.1093/database/baz093